PCR實驗室入門級別的知識要點

一、PCR實驗室的設計（jì）原則
原（yuán）則上應當設置4個區域：試劑儲存和準備區、標本製備區、擴增區、擴增產物分析區。
根據（jù）使（shǐ）用儀器的功能，區域可適（shì）當合並。
使用實時熒（yíng）光PCR儀，擴增區、擴增產（chǎn）物分析區可合並；
采用樣本處（chù）理、核酸提取及擴增（zēng）檢測為一體的（de）自動化分析儀，則標本（běn）製備區、擴增區（qū）、擴增產物分析（xī）區可合（hé）並。
各區功能準備物品（pǐn）清單：
1、試劑儲存（cún）和準備區（1區）
功能：貯存試劑的製備、試劑的分裝和擴增反應混合液的準備，以及（jí）離（lí）心管、吸頭等消耗品的貯（zhù）存和準備。
準備物品（pǐn）：
（1）2～8℃和-20℃以下冰箱
（2）混勻器
（3）微量加樣器（覆蓋0.2-1000µl）
2、標本製備區（qū）（2區）
功能：核酸（RNA、DNA）提（tí）取、貯（zhù）存及其加入至擴增反應（yīng）管。對於涉及臨床樣本的操作，應符（fú）合生物安全二級實驗室防護設備、個人（rén）防（fáng）護和操作規範的要求。
準備物品：
（1）2-8℃冰箱、-20℃或-80℃冰箱
（2）高速離心機
（3）混勻器
（4）水浴箱或加熱模塊
（5）微（wēi）量加樣（yàng）器（覆蓋0.2-1000µl）
（6）生物安全櫃。
3、擴增（zēng）區（3區）
功能：cDNA合成、DNA擴增及檢測。
準備物（wù）品：核酸擴增儀（或熒光定量PCR儀）
4、擴增產（chǎn）物分析區（4區）
功能：擴增片段的（de）進一步分（fèn）析測（cè）定，如雜交、酶切電泳、變性高效液相分析、測（cè）序等。
準備物品：
（1）雜交儀、電泳儀、測序儀（yí）等
（2）微量（liàng）加樣器（覆蓋0.2-1000µl）
通用（yòng）物品（pǐn）：（4個區都有可能需要）
（1）可移動紫（zǐ）外燈（近工作台麵）
（2）消耗品：一次性手套、耐高壓處（chù）理的離心管和（hé）加樣器吸頭
（3）專用工作服和工作鞋(套)
（4）專用辦公用品
（5）樣本（běn）管架（2區）
（6）防爆夾（2區）
（7）PCR管架（2區、傳遞（dì）窗）
二、PCR實驗室工作基本原則
1、進入各工作區域應當嚴格按照單一方向進行
試劑儲存和（hé）準備區→標本製備區→擴增區→ 擴增產物分析區。
2、各工作區域必須有明確的標記，不同工作區域內的（de）設（shè）備、物（wù）品不得混用。
3、不同的工作區域（yù）使用（yòng）不同的工作服（例如不同的顏色）。工作人員離開各工（gōng）作（zuò）區域時，不得將工作服帶出。
4、實（shí）驗室的清潔應當按試劑貯（zhù）存和（hé）準（zhǔn）備（bèi）區→標本製備區→擴增區→擴增產物分析區的方向進行。不同的實驗區域應當有其各（gè）自的清潔用具以防止交叉汙染。
5、工作結束後，必須立即對工作區進行清潔。工作（zuò）區的實驗台表麵應當可耐（nài）受諸如次氯酸鈉的化學物（wù）質的消毒（dú）清潔作用。實（shí）驗台表麵的紫外照射應當方（fāng）便有效。由（yóu）於紫外照射的距離（lí）和能量對去汙染的效果非（fēi）常關鍵，因此可（kě）使用可移動紫外燈（dēng）（254nm波長），在工作完成後調至實驗台上（shàng）60～90cm內照射。由於擴增產物僅幾百或幾十堿基對（bp），對紫外線損傷不敏感（gǎn），因此紫外照（zhào）射擴增片（piàn）段必須延長照射時間，最好是照射過夜。
6、實驗室的安全工作製度或安全標準操作程序（xù），所有操（cāo）作符合（hé）《實驗室生物安全通用（yòng）要求》（GB19489-2008）。
三、注意事項
1、試（shì）劑儲存和準備區（qū）
貯存試劑和用於標本製（zhì）備的（de）消耗品（pǐn）等材（cái）料應當（dāng）直接運送至試劑貯（zhù）存和準備區，不（bú）能經過（guò）擴增檢測區，試（shì）劑盒（hé）中的陽性對照品及質控品（pǐn）不應當保存在該區，應當保存在標本處理區。
2、標（biāo）本製（zhì）備區
由於在樣本混（hún）合、核（hé）酸純化過程中可能會發生（shēng）氣溶膠所致的汙（wū）染，可通過在本區內設立正壓條件，避免（miǎn）從鄰近區進（jìn）入本區的氣溶膠汙（wū）染。為（wéi）避免樣本間的交叉汙染，加入待測（cè）核酸後，必須蓋好含反應混合液的反應管。對（duì）具有潛在傳染危險性的材料（liào），必須在生物安全（quán）櫃內開（kāi）蓋，並有明確的樣本處理和滅（miè）活程序。
3、擴增區
為避免氣溶膠所致的汙染，應當盡量減（jiǎn）少在本區內的走動。必須注意的是，所有經過檢測的反應管不得在此區域打開（kāi）。
4、擴增產物分析區（qū）
核（hé）酸擴（kuò）增後產物（wù）的分析方（fāng）法多種多樣（yàng），如膜上或微孔板或芯片上（shàng）探針雜交方法（fǎ）（放射性核素標記或非放射性核素標記（jì））、直接或酶切後瓊脂糖凝膠電泳、聚（jù）丙烯酰胺凝膠電（diàn）泳（yǒng）、Southern轉移、核酸測序方（fāng）法、質譜分（fèn）析等（děng）。本（běn）區是最主要的擴增產物汙染來源（yuán），因此必須注意避免通過本區的物品及工作服將擴增產（chǎn）物帶出。在使用（yòng）PCR-ELISA方法檢測擴增（zēng）產物時，必須使（shǐ）用洗板機洗板，廢液必須收集至1 mol/L HCl中，並且不能在實驗室內傾倒，而應當至遠離PCR實驗室的地方棄掉（diào）。用過的（de）吸頭也必須放至1 mol/L HCl中浸泡（pào）後（hòu）再放到垃圾（jī）袋中按程序處理（lǐ），如焚燒。由於本區有可能（néng）會（huì）用（yòng）到某些可致基因突（tū）變和有毒物質如溴（xiù）化乙錠、丙烯酰胺（àn）、甲醛（quán）或（huò）放射性核素等，故應當注意實驗（yàn）人員（yuán）的安全（quán）防護。